甲状旁腺激素类似物及其应用的制作方法

  在国家卫生研究院授予的基金DK-11794下，在美国政府的支持下，做出本发明。 美国政府对本发明具有某些权利。技术领域

  通常，本发明涉及甲状旁腺激素(PTH)类似物，具体地是在PTH受体上具有长效激动剂活性的那些。这些类似物可用来医治其中期望长效活性的疾病，如甲状旁腺功能减退。

  PTH (1-34)是骨质疏松症和PTH缺乏病症，即甲状旁腺功能减退的治疗中有效的治疗剂。甲状旁腺功能减退是由甲状旁腺的甲状旁腺激素(PTH)产生不足所表征的终身疾病(life-long disease)。因为PTH是调节钙和磷酸盐水平的关键，PTH的损失减少血液和骨中的钙水平和增加磷酸盐水平(血钙过少和血磷酸盐过多)。血钙过少导致症状如神经肌肉兴奋性，包含感觉异常、肌肉颤搐、喉部痉挛(其可导致不能说话和不能向医疗服务者 (health providers)提供潜在医学病症的警报，其导致延迟的或错误的治疗)、以及可能手足抽搐和痉挛。它仅仅是内分泌紊乱，其中缺少的激素(即PTH)还没有用作治疗。

  因而，需要另外的PTH受体激动剂，特别是在PTH受体上具有长效活性的那些。发明内容

  本发明涉及PTH和PTHrP类似物的开发(发展,development)。此处描述的典型的多肽，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK在体外和体内对PTH受体具有长效活性，且在中性水溶液中表现高的溶解性。因此，本发明的多肽适于其中期望长效活性的疾病的治疗，包含甲状旁腺功能减退(hypoparathyro i di sm)。

  因此，本发明特征是多肽(例如，分离的)，或其药学可接受的盐，包含式⑴的氨基酸序列

  在某些实施例中，多肽基本上相同于上述描述的多肽(例如，至少90%或95%相同) (例如，其中X18和X22是Ala和其中X26是Lys)。在某些实施例中，如与SP-PTH比较，多肽在中性水溶液中(例如，pH为7. 4的磷酸盐缓冲盐(PBS))表现更高的溶解性(例如，如与在酸性溶液(例如，pH为1、2、3、4，如IOmM乙酸(pH为2. 9))中比较，至少40%、50%、60%、70%、 80%、90%、或95%溶于中性水溶液中)。在某些实施例中，多肽是生物学上活性的多肽(例如， PTH受体激动剂)。在某些实施例中，多肽以比hPTH (1-34)高的亲和力结合到人类PTH-1 受体的R°状态(R°state)上。在其他实施例中，多肽的长度小于200、150、100、75、50、40、 39、38、或37个氨基酸。可在它的C-末端酰胺化多肽。

  或包含所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的它的片段。在其他实施例中，多肽包含或是选自由下列序列组成的组的氨基酸序列

  本发明特征也在于包含本发明的多肽的药物组合物(例如，上述或此处描述的任何多肽)和药学上可接受的载体。

  本发明特征还在于用来医治受试者的方法，其中所述受试者具有，例如，选自由甲状旁腺功能减退、血磷酸盐过多、骨质疏松症、骨折修复(fracture repair)、骨软化、关节炎、和血小板减少症组成的组的疾病。该方法包含给予受试者足够治疗疾病的量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的药物组合物。例如，可皮下地、静脉内地、鼻内地、经肺部地、 经皮地、和口服地给予多肽或药物组合物。

  本发明特征还在于包含编码本发明的多肽的序列的核酸。可操作地将核酸连接到启动子上。核酸可以是载体的部分。本发明特征还在于包含载体的细胞，以及通过在其中表达编码的多肽的条件下培养细胞来生产多肽的方法。

  就“治疗”来说，意味着，与未经治疗的等同对照比较，在患有病症或疾病的受试者 (例如，诊断具有甲状旁腺功能减退的受试者)中改善病症或疾病的至少一个症状。如通过任何标准技术测量，症状的这种减轻(例如，血液钙水平的减少或血清磷酸盐水平的增加) 至少是 5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、或 100%。

  就“纯化的多肽”或“分离的多肽”来说，意味着已经和其他成分分离开的多肽。一般，当按重量计，它至少是30%不含其他成分时，多肽是基本上纯的。在某些实施例中，按重量计，制品至少是50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%不含其他成分。例如，可通过从天然来源提取；通过编码这样的多肽的重组多聚核苷酸的表达；或通过化学方法合成多肽获得纯化的多肽。可通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或通过HPLC分析。

  就“生物学上活性”来说，意味着，化合物或组合物(例如，此处描述的多肽)在给予细胞或动物(例如，人或非人哺乳动物)之后具有至少一种生物学上显著的效应。PTH、 PTHrP、和其类似物(例如，此处描述的那些)的生物活性包含，但不限于，受体结合、cAMP或 IP3生产、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C、磷脂酶D、和磷脂酶A2活化、细胞内的改变(例如，增加或减少)、血浆、或尿钙或磷酸盐水平、和体内或体外骨新陈代谢或分解代谢中的改变。与适当的对照(例如，野生型多肽或它的拟表型如PTH (1-34)或PTHrP (1_36))比较，例如，本发明的生物学上活性的多肽(例如，此处描述的任何多肽)，在任何生物活性中可表现增加(例如，至少 5%、10%、25%、50%、100%、500%、1000%、10，000%)或减少(例如，95%、90%、 75%、50%、25%、10%、5%、1%、0· 1%、0· 01%、或 O. 001%)。

  图7A和7B是显示在冲掉配体之后，cAMP刺激的图表。图7A显示pmol/孔的cAMP 产生，以及图7B显示关于每一配体针对最大cAMP刺激而标准化的这些结果。

  和图8D (0-54小时)中，显示关于以lOnmol/kg皮下注射肽的相似结果。也显示了在禁食条件下来自相似实验的结果(图 8E)。

  图9是显示用于测量血钙、血清磷酸盐水平、和在TPTX大鼠的尿中钙-对-肌氨酸酐比率的实验方案的示意图。

  图1IA是显示在接受SP-PTH或SP-PTH-AAK静脉注射的食蟹猴(猕猴)中，用于测量血清和尿钙和磷酸盐水平的实验方案的示意图。

  图1lB是显示在静脉注射lnmol/kg之后，猴中的SP-PTH的血浆浓度的图表。

  图16A和16B是显示多肽在pH为7. 4的PBS溶液中的溶解性的图表。

  图16C显示SP-PTH-AAK在5、25、和40°C下在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中和IOmM 乙酸中的稳定性。与开始样品比较，通过rPHPLC测量样品中剩余的完整SP-PTH-AAK肽的量。

  图19是显示在表达野生型或ro PTH受体的小鼠中，SP-PTH-AAK对血钙水平的影响的图表。

  本发明涉及在PTH受体上具有延长的活性的新的甲状旁腺激素(PTH)类似物。 通过 SP-PTH-AAK ([Ala1’3’12’18’22, Gln10, Arg11，Trp14，Lys26] PTH (1-14)/PTHrP (15-36))和 Aib-SP-PTH-AAK (Ala1’12’18’22，Aib3，Gln1。，高 Arg11, Trp14, Lys26] PTH (1-14) /PTHrP (15-36)) 例示这些类似物。如下面描述的，在体外，这些多肽以比PTH (1-34)和其他参考多肽高的亲和力结合到PTH-1受体(PTHRl)的非-G蛋白偶联的(、结合的，coupled) Rtl构型上。因此，这些多肽在培养的细胞中诱导延长的cAMP信号响应。与PTH (1-34)或其他测试类似物比较，这些多肽在实验室测试动物(小鼠、大鼠、和猴)中的血液离子化的钙水平中也表现延长的增加。由于它们在体内证实的长效性能，这些类似物对于诸如甲状旁腺功能减退的病症的治疗具有效用。

  典型的多肽，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK，包含基于人类PTH (1-14)序列的 N-末端部分和基于人类PTHrP序列(参考下面表I)的C-末端部分，具有含有亲和力_增强的氨基酸替代(取代，substitution)的N-和C-末端部分。如下面实例中说明的,这些多肽在体外表现令人惊讶的高结合亲和力和cAMP信号效力，以及体内增强的功能效应。最后，如下面描述的，与野生型PTH (1-34)多肽比较，这些多肽表现高的溶解性。基于这些性能，这些多肽可用于其中期望延长的对PTH受体的活性的任何应用，例如，用于甲状旁腺功能减退的治疗。PTH激动剂的R° vs. RG结合如PCT公开WO 2009/017809中描述的，识别了 PTH受体的新的“R°”状态，其中受体不结合到它的G-蛋白上，但能进行激动剂结合。先前已经认为，可区分G-蛋白-偶联的受体的两种形式结合到G-蛋白上的形式(RG)和不结合到G-蛋白上的形式(R)15GPCR 信号(传导)一定要通过受体直接地激活G-蛋白，例如，必须形成RG状态，且可通过激动剂配体的结合诱导这种RG形成。激动剂配体的结合诱导或稳定RG状态，反过来，RG状态稳定激动剂的高亲和力结合。在结合GTP，或非-可水解的GTP类似物，例如，GTP Y S之后， 将从受体分离受体-偶联的G蛋白，引起受体恢复到低亲和力状态。现在，已经公认某些 GPCR，象PTHR，可形成新的状态(R°)，其可在有GTP y S的情况下，因此，甚至在受体预期不结合G蛋白时，也可以高亲和力结合某些激动剂配体。基于R°状态的这种发现，PCT公开WO 2009/017809描述了，除了以高亲和力结合RG状态之外，以高亲和力结合到R°状态上的配体，比以较低的亲和力结合到R°上的配体具有更长的活性半衰期。这种延长的活性不依赖于配体在体内的生物利用度或药物代谢动力学。相应地，具有短的作用维持的时间的激动剂对于受体的R°形式具有较低的亲和力。

  如下面实例中描述的，与在体外的hPTH (1-34)比较，SP-PTH-AAK和 Aib-SP-PTH-AAK对PTH受体的R°形式表现显著更高的结合，在体外和体内表现长效活性。 因此，本发明的多肽适于用作长效PTH激动剂。

  本发明的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)适于通过液-相或固-相肽合成和通过利用组合化学(combination chemistry)的原位合成来生产。具体地，固相肽合成技术已被成功地用于人类PTH的生产且可用于这些化合物的生产(关于指导，参考，上文的 Kimura等人和 Fairwell 等人，Biochem. 22:2691，1983)。已经在Goud等人 J Bone Min Res6:781, 1991中报道了以相对大规模生产人类PTH的成功。合成肽的合成方法通常涉及自动化的合成仪和作为固相的适当的树脂的应用，其中将树脂连接到期望的多肽的C-末端氨基酸上。然后通过顺序地连接下一个期望的氨基酸的适当保护形式完成N-末端方向的肽延伸，一般利用FMOC-或BOC-基化学方案，直到完成合成。然后从肽中清除保护基团， 通 常同时从树脂上分离肽，然后分离肽和利用传统技术纯化肽，如通过利用乙腈作为溶剂和利用三氟乙酸作为离子配对试剂进行反相HPLC。通常在许多出版物中描述这样的程序， 例如可参考Stewart and Young, iiSolid Phase Peptide Synthesis,，，2nd Edition, Pierce Chemical Company, Rockford, IL(1984)。

  也可通过本领域已知的任何方法重组地制备本发明的多肽。原核(例如,细菌)和真核(例如，酵母和哺乳动物)表达系统也可用来生产本发明的多肽，特别是其中多肽只包含基因组编码的氨基酸的情况(例如，不是Aib或Har)。

  本发明的任何多肽可进一步包含异源序列(融合伴侣)，因此形成融合蛋白。融合蛋白可包含融合伴侣如纯化和检测标签，例如，可直接地或间接地检测的蛋白质如绿色荧光蛋白、红血球凝集素、或碱性磷酸酯酶，DNA结合结构域(例如，GAL4或LexA)， 基因活化结构域(例如，GAL4或VP16)，纯化标签、或分泌信号肽(例如，前原胰蛋白酶 (preprotyrypsin)信号序列)。在其他实施例中，融合伴侣可以是标签，如c_myc、多聚组氨酸、或FLAG。每一个融合伴侣可含有一个或更多结构域，例如，促胰岛素信号序列和FLAG标签。在其他情形中，融合伴侣是Fe蛋白质(例如，小鼠Fe或人Fe)。

  可利用此处描述的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)治疗PTH机能不良或钙或磷酸盐不平衡关联的任何疾病。多肽可用来医治甲状旁腺功能减退、血磷酸盐过多、骨质疏松症、骨折修复、骨软化、关节炎、或血小板减少症，或可用于增加受试者的干细胞活化(mobilization)。给予的任何模式(例如，口服、静脉内的、肌肉的、眼部的、局部的 (topical)、皮肤的、皮下的、和直肠的)可用于本发明的治疗方法。医师将决定用于被治疗的病人的适当的剂量，其将部分地依赖于病人的年龄和尺寸、疾病或病症的严重性、和被治疗的具体的疾病或病症。

  可配制药物组合物从在给予之后立即或在给予之后的任何预定时间或时间段释放活性化合物。后面类型的组合物通常被称为受控释放制剂，其包含(i)在延长的时段， 在身体内形成本发明试剂基本恒定浓度的制剂；(ii)在延长的时段，在预定间隔时间(lag time)之后,在身体内形成本发明试剂的基本恒定浓度的制剂；(iii)在预先确定的时段， 通过维持身体中的试剂相对不变的、有效的水平维持试剂的作用同时伴随在试剂的血浆水平中的波动关联的不期望的最小副作用的制剂(锯齿动力学模式);(iv)局部化试剂作用的制剂，例如，受控释放组合物邻近或在患病组织或器官中的空间放置；(V)达到定量给予的便利的制剂，例如，每周一次或每隔两周一次给予组合物jP(vi)通过利用载体或化学衍生物递送化合物，将试剂的作用靶向具体的靶细胞类型的制剂。以受控释放制剂的形式给予化合物对于在胃肠道中具有窄吸收窗口或相对短的生物半衰期的化合物是特别优选的。

  为了获得受控释放，可进行多种策略中的任一种，其中释放的速率超过所讨论化合物的新陈代谢的速率。在一个实例中，通过种种配方参数和成分的适当的选择获得受控释放，包含，例如，很多类型的受控释放组合物和涂层。因而，利用适当的赋形剂将化合物配制到药物组合物中，其在给予之后，以受控方式释放化合物。实例包含单或多单位(unit) 片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳剂、微胶囊、分子复合物、微球体、纳米颗粒、贴剂 (patch)、和脂质体。

  可肠胃外地通过注射、灌输、或移植(皮下的、静脉内的、肌肉的、腹膜内的，等等)， 以剂型、制剂、或通过适当的递送设备或含有传统的、无毒的药学上可接受的载体和佐剂的植入物给予含有此处描述的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)的组合物。这样的组合物的制剂和配制是药物制剂领域的技术人员所公知的。

  可以单位剂型(例如，单剂量安瓿)，或在含有几种剂量以及可在其中添加适当的防腐剂的小瓶中(参加下文)提供适于肠胃外应用的组合物。组合物可以是溶液、悬浮液、乳剂、输注设备、或适于移植的递送设备的形式，或它可呈现为在使用之前要利用水或另外的适当媒介物复配(复溶，reconstitute)的干粉。除了活性剂之外,组合物可包含适当的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性剂可包含在适于受控释放的微球体、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。此外，组合物可包含悬浮剂、增溶剂、稳定剂、PH-调节剂、张性调节剂、和/ 或分散剂。

  如上述指出的，依照本发明，药物组合物可以为适于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将适当的活性剂溶解在或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。在可接受的媒介物和溶剂中可采用的是水，通过添加适当量的盐酸、氢氧化钠或适当的缓冲液、1，3-丁二醇、林格氏溶液、葡萄糖溶液、和等张的氯化钠溶液，将水的PH调整到适当的pH。水性制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种化合物仅难溶或微溶于水的情形中，可添加溶解增强剂或增溶剂，或溶剂可包含10-60%w/w的丙二醇等。

  8.依据权利要求1-7的任一项所述的多肽，其中与SP-PTH比较，所述多肽在中性水溶液中表现更大的溶解性。

  9.依据权利要求1-8的任一项所述的多肽，其中所述多肽是PTH受体激动剂。

  10.根据权利要求1-9的任一项所述的多肽，其中所述多肽以比hPTH(1-34)更高的亲和力结合到人类PTH-1受体的R°状态上。

  11.根据权利要求1-10的任一项所述的多肽，其中所述多肽的长度小于50个氨基酸。

  17.一种药物组合物，包括权利要求1-16的任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。

  18.根据权利要求1-16的任一项所述的多肽，其中通过固相合成来合成所述多肽。

  19.一种用来医治受试者的方法，所述受试者具有选自由甲状旁腺功能减退、血磷酸盐 过多、骨质疏松症、骨折修复、骨软化、关节炎、和血小板减少症所组成的组中的疾病，所描述的方法包括给予所述受试者足够治疗所述疾病的量的权利要求1-16的任一项所述的多肽或权利要求17所述的药物组合物。

  20.根据权利要求19所述的方法，其中给予的途径选自由皮下、静脉内、鼻内、经肺部、经皮肤、以及口服所组成的组。

  25.一种制造多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求24所述的细胞。

  披露了两种PTH类似物配体，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK，如在体外和体内证明的，其对PTH受体具有长效活性。因此，这些多肽非常适合于治疗其中期望长效活性的疾病，如甲状旁腺功能减退。还披露了制备这些类似物多肽的方法。

  发明者托马斯·J·加德拉, 约翰·T·波茨, 哈拉尔德·朱佩内尔, 冈崎诚 申请人:总医院有限公司, 中外制药株式会社

  技术研发人员：托马斯·J·加德拉;约翰·T·波茨;哈拉尔德·朱佩内尔;冈崎诚

  如您需求助技术专家，请点此查看客服电线.植物资源精细化工与化学 3.生物质精炼 4.天然产物化学

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  1. 基于糖类的抗肿瘤药物的合成和活性评价及糖类疫苗的研制 2.功能糖类的化学酶法合成及构效关系研究 3.多糖及仿生材料功能的开发及应用

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  甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽合成和治疗骨质疏松症的用途的制作的过程

  甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽合成和治疗骨质疏松症的用途的制作方法

  甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽合成和治疗骨质疏松症的用途的制作方法

  甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽合成和治疗骨质疏松症的用途的制作方法

  促进甲状旁腺激素释放的芳基－喹唑啉/芳基－2－氨基－苯基甲酮衍生物的制作方法

  甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽合成和治疗骨质疏松症的用途的制作方法